迷迭香酸對(duì)慢性腎功能研究

時(shí)間:2022-10-28 10:32:00

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迷迭香酸對(duì)慢性腎功能研究

作者:林威遠(yuǎn),黃榮桂,鄭興中

【摘要】目的觀察迷迭香酸對(duì)慢性腎功能不全模型大鼠系膜基質(zhì)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)的影響。方法制作大鼠慢性腎功能不全模型(5/6腎切除),以迷迭香酸作為干預(yù)因素,應(yīng)用免疫組織化學(xué)半定量法測(cè)定迷迭香酸對(duì)大鼠系膜基質(zhì)成分纖維連接蛋白(Fn)、膠原Ⅳ(ColⅣ)及TGFβ1的影響,電鏡觀察腎小球病理學(xué)變化,測(cè)定血、尿肌酐值。結(jié)果(1)與對(duì)照組比較,迷迭香酸組肌酐清除率(Ccr)水平升高(P<0.05);(2)Fn、ColⅣ在腎臟細(xì)胞外基質(zhì)的沉積減少(P<0.05);(3)TGFβ1表達(dá)減少(P<0.05)。結(jié)論迷迭香酸可以抑制TGFβ1的表達(dá),減少Fn及ColⅣ在腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,延緩腎小球硬化,對(duì)慢性腎功能不全疾病可能具有治療價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】迷迭香酸;腎小球;細(xì)胞外基質(zhì);腎切除術(shù);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β;疾病模型,動(dòng)物

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的增加是慢性進(jìn)行性腎小球病變的特征,腎小球ECM積聚是腎小球疾病發(fā)展至腎小球硬化的主要病理改變基礎(chǔ)。多種細(xì)胞因子通過(guò)對(duì)系膜細(xì)胞的作用參與調(diào)節(jié)腎小球ECM的分泌,導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)和功能的異常,促進(jìn)腎小球硬化。迷迭香酸(rosmarinicacid)為水溶性的多酚類化合物。1958年由Ellis首次從唇形科植物迷迭香(RosmarinusoffinalisL.)中分離得到,在植物中分布較為廣泛,主要存在于唇形科、紫草科、葫蘆科、椴樹(shù)科、傘形科的多種植物中。由于迷迭香酸為天然抗氧化劑,有抗炎、免疫抑制等多種活性,對(duì)其進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)具有一定的意義。筆者觀察迷迭香酸對(duì)慢性腎功能不全模型大鼠系膜基質(zhì)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)的影響。

1材料與方法

1.1材料成年雄性SD大鼠20只,6~8周齡,體質(zhì)量(175±15)g[上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCCKCC(滬)20030002]。纖維連接蛋白(Fn)、膠原Ⅳ(ColⅣ)、TGFβ1免疫組織化學(xué)(SABC法)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。迷迭香酸(含量97%,美國(guó)Aldrich公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備大鼠分籠飼養(yǎng)于室溫、日光照12h、45%濕度的環(huán)境中,自由飲水,進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。1周后采用Platt法切除5/6腎制作慢性腎功能不全模型[1],分2期完成:先背部切口切除左腎2/3,1周后切除完整右腎。術(shù)后2周靜脈采血0.5mL,查肌酐值,明顯高于正常值(35~53μmol/L)者符合入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2分組模型大鼠分為模型組和迷迭香酸組,未手術(shù)大鼠為對(duì)照組,每組6只。迷迭香酸組給予迷迭香酸100mg·kg-1·d-1灌胃,另2組給予等容積蒸餾水灌胃。8周后,留24h尿及心臟取血備查;切開(kāi)腹腔,取出腎臟,4%甲醛緩沖液固定,石蠟包埋。另取部分腎組織,送電鏡室檢查。

1.2.3免疫組織化學(xué)觀察采用SABC法,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。高倍鏡(×200)下隨機(jī)選擇20個(gè)腎小球和20個(gè)腎小管間質(zhì),根據(jù)染色面積和強(qiáng)度進(jìn)行半定量評(píng)分:無(wú)染色或微弱染色為0,染色面積<25%為1,25%~50%為2,50%~75%為3,>75%為4;基本不著色為0,著色淡者(淡黃)為1,適中者(棕黃)為2,深者(棕褐)為3。兩者得分相加為最終值。

1.2.4尿肌酐和血肌酐測(cè)定采用全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)Becman公司)檢測(cè)尿肌酐和血肌酐值,按公式換算成肌酐清除率:

肌酐清除率=[尿肌酐濃度(mg/mL)×1min尿量(mL)]/血肌酐濃度(mg/mL)

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示,采用SPSS11.0處理方差檢驗(yàn)組間差異。組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)觀測(cè)評(píng)分迷迭香酸可以抑制TGFβ1表達(dá),減少Fn及ColⅣ在腎ECM沉積(表1)。

2.2免疫組織化學(xué)改變與對(duì)照組比較,模型組Fn及ColⅣ表達(dá)明顯增多,腎小球黃色及棕黃色、棕褐色面積大,著色深;迷迭香酸組Fn及ColⅣ表達(dá)較對(duì)照組減少,黃色及棕黃色面積小,著色較淺。模型組TGFβ1表達(dá)較對(duì)照組明顯增多,腎小管及間質(zhì)黃色及棕黃色面積大,著色深;迷迭香酸組TGFβ1表達(dá)較對(duì)照組減少,黃色及棕黃色面積小,著色較淺(圖1)。

表1腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)及TGFβ1評(píng)分(略)

Tab1TheeffectsofrosmarinicacidontheglomerularmesangiummatrixandTGFβ1

n=6.Fn:纖維連接蛋白;ColⅣ:膠原Ⅳ;TGFβ1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1.與模型組比較,☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

Fn:纖維連接蛋白;ColⅣ:膠原Ⅳ;TGFβ1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1.A:對(duì)照組;B:模型組;C:迷迭香酸組.

圖1Fn、ColⅣ、TGFβ1表達(dá)(SABC法×200)(略)

Fig1TheexpressionofFn,ColⅣandTGFβ1inthekidneys(SABC×200)

2.3病理學(xué)改變光鏡:模型組腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生明顯,有不同程度的萎縮、硬化,小球基底膜增厚,囊周纖維化,腎小管有擴(kuò)張和萎縮,間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),伴纖維增生。迷迭香酸組系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生程度和硬化程度較輕,基底膜較薄,腎小管擴(kuò)張和萎縮改善,可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

電鏡:模型組系膜細(xì)胞增生及系膜基質(zhì)增生、擴(kuò)大明顯,并有少量沉積物,內(nèi)皮下大量沉積物,上皮足突明顯融合,結(jié)構(gòu)紊亂;基底膜增厚,毛細(xì)血管壁增厚、萎陷;線粒體腫脹,溶酶體增多。迷迭香酸組系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生程度較輕,足突結(jié)構(gòu)基本正常,部分區(qū)域有輕度融合,基底膜增厚不明顯(圖2)。

2.4血肌酐、內(nèi)生肌酐清除率的變化迷迭香酸對(duì)大鼠血肌酐、內(nèi)生肌酐清除率的影響見(jiàn)表2。

3討論

3.1腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)在腎衰過(guò)程中的作用腎小球系膜細(xì)胞的ECM合成和降解的平衡對(duì)基質(zhì)增生與否起關(guān)鍵作用[2]。大量研究證明,ColⅣ分泌增多或多肽鏈結(jié)構(gòu)異常均影響GBM的分子結(jié)構(gòu),導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)功能異常。近年研究發(fā)現(xiàn),在腎小球硬化進(jìn)展過(guò)程伴有ColⅣ合成和/或降解異常,使其在病變腎小球中積聚,參與了硬化灶的形成[34]。在體內(nèi)Fn有血漿型和組織型兩種,在慢性腎功能衰竭時(shí)血漿型Fn消耗增加而產(chǎn)生抑制,故明顯下降,但組織型Fn在組織中大量積聚[5]。本組大鼠模型有相同的表現(xiàn)。

3.2迷迭香酸的藥理作用及機(jī)制迷迭香酸是咖啡酸和3,4二羥苯基乳酸形成的酯類,屬于咖啡酸的一種衍生物,具有一系列的藥理作用,如抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗血小板聚集及抗血栓、抗系膜細(xì)胞增殖等作用[6]。對(duì)于迷迭香酸對(duì)腎小球ECM及細(xì)胞因子的影響方法,Makino等觀察迷迭香酸對(duì)兔抗鼠胸腺細(xì)胞血清誘導(dǎo)的系膜增殖型腎炎大鼠模型的影響,發(fā)現(xiàn)口服迷迭香酸(100mg·kg-1·d-1)8d后,系膜細(xì)胞增殖及系膜基質(zhì)增生明顯抑制,認(rèn)為迷迭香酸主要通過(guò)它的纖維蛋白溶解活性及抗氧化活性而產(chǎn)生上述作用。他還觀察了迷迭香酸對(duì)體外培養(yǎng)的鼠系膜細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)它能抑制PDGF或TNFβ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖,主要作用于G0/G1及G1/S期的細(xì)胞,認(rèn)為該作用機(jī)制主要是迷迭香酸抑制了系膜細(xì)胞PDGF及CmycmRNA的表達(dá)[78]。

A:對(duì)照組;B:模型組;C:迷迭香酸組

圖2腎小球的病理學(xué)改變(×3600)(略)

Fig2Thepathologyoftherenalconstitutionexamined(×3600)

表2大鼠血肌酐、內(nèi)生肌酐清除率(略)

Tab2TheeffectsofrosmarinicacidonthetheScrandCcrofrats

n=6.Scr:血肌酐;Ccr:內(nèi)生肌酐.與模型組比較,☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

3.3TGFβ對(duì)慢性腎功能衰竭的影響TGFβ是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的多肽,促使ECM沉積,主要通過(guò)以下3個(gè)途徑:(1)明顯增加ECM膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型以及Fn表達(dá);(2)通過(guò)減少M(fèi)MP表達(dá)以及促進(jìn)PAI(纖溶酶原激活抑制物)和TIMP的合成來(lái)減少ECM的降解;(3)刺激ECM受體——整合素的合成,使細(xì)胞粘附于ECM,而富含ECM的基膜也作用于細(xì)胞,調(diào)控TGFβ的產(chǎn)生。Takashi等用NorthernBlot雜交發(fā)現(xiàn)殘余腎小球有TGFβ1mRNA的表達(dá),進(jìn)一步觀察到尿毒癥時(shí)血清硫酸吲哚酚含量增高,利用5/6腎切除大鼠模型通過(guò)飲水和腹腔注射給予硫酸吲哚酚,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)2.5周時(shí)殘腎TGFβ1mRNA表達(dá)增加,而肌酐、肌酐清除率正常,但5周時(shí)則出現(xiàn)腎功能下降,證明TGFβ1mRNA的異常高表達(dá)是慢性腎衰進(jìn)展的啟動(dòng)因素而非結(jié)果的表現(xiàn)[9]。Yamamoto等用免疫染色和原位雜交技術(shù)檢測(cè)人腎小球疾病TGFβ及mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)基質(zhì)增多不明顯的腎小球疾病中TGFβ表達(dá)明顯增強(qiáng),另外還見(jiàn)到TGFβ的3個(gè)亞型中以TGFβ1型表達(dá)加強(qiáng)為主,可見(jiàn)TGFβ1的表達(dá)與基質(zhì)病理性增多有關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,迷迭香酸對(duì)TGFβ1的表達(dá)有抑制作用,可改善腎臟纖維化。

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